【研究背景】

土壤是微生物棲居的主要場(chǎng)所。微生物在土壤中的分布及生命活動(dòng)與土壤肥力、植物營(yíng)養、植物病害和植被狀況等密切相關(guān)。微生物是生態(tài)系統的重要組成部分，推動(dòng)著(zhù)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，在生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著(zhù)重要的角色，許多酶和抗生素等生物活性物質(zhì)均來(lái)自于微生物。據統計，每克土壤約含有107個(gè)微生物細胞，但用傳統技術(shù)培養的微生物僅占微生物總數的0.01％～10％而大部分微生物處于不可培養的狀態(tài)，因此，相當多的菌種由于無(wú)法培養而不能被充分的?開(kāi)發(fā)和利用。另外，土壤微生物對所生存的微環(huán)境十分敏感，是常用的土壤生態(tài)系統變化的預警及敏感指標。將近些年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)（如PCR-DGGE、ARDRA、RFLP等）運用到土壤微生物生態(tài)學(xué)的研究，可避開(kāi)傳統的微生物分離培養過(guò)程，直接探討土壤中微生物的多樣性變化及其與環(huán)境的關(guān)系，克服因土壤微生物可培養性的差異引起的分析偏差。這些分子生物學(xué)方法主要通過(guò)提取土壤中微生物總DNA，并對特定DNA序列（如16S rDNA基因）進(jìn)行擴增，通過(guò)分析擴增產(chǎn)物的多樣性來(lái)推斷微生物群落的多樣性。因此，從自然環(huán)境土壤中提取高純度、高質(zhì)量的微生物總DNA對后續研究都是相當重要的。

【實(shí)驗器材】

1．實(shí)驗材料不同生態(tài)環(huán)境的根際土壤樣品。

2．試劑DNA抽提緩沖液（根據提取方法選擇）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、DNA Marker、苯酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）、70％酒精，16S rDNA通用引物。

3．儀器和用具離心機、水浴鍋、電泳儀及電泳槽。

【實(shí)驗設計思路】

1．從土壤中提取微生物總DNA

（1）裂解細胞。方法包括：①物理法，如玻璃珠研磨振蕩、超聲波、微波、凍融、煮沸、研缽研磨等。②化學(xué)法，如用表面活性劑SDS、熱酚、高鹽等。③酶解法，如用裂解酶、溶菌酶、蛋白酶、無(wú)色肽酶、鏈霉蛋白酶等。④聯(lián)合裂解法，是物理、化學(xué)方法的綜合利用。

（2）提取核酸。一般采用酚／氯仿／異戊醇抽提法。

（3）核酸的純化。方法有：①電泳法。在1％低熔點(diǎn)脂糖凝膠中電泳，切下含DNA的凝膠，回收。②分子篩法。用Sephadeex G50和G200純化核酸。③選擇沉淀法。用亞精胺-HCl在低鹽條件下沉淀DNA，回收。④商品純化柱法。

2．總DNA的純度判斷

土壤中含有大量的腐殖酸，因此在提取的過(guò)程中會(huì )有腐殖酸污染。腐殖酸可以螯合Mg2＋，或和DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結合，從而抑制酶的活性，影響后續的實(shí)驗操作。由于腐殖酸在230nm處有個(gè)吸收峰，通過(guò)估算OD260/OD230值可確定所提取的DNA中腐殖酸的污染程度：OD260/OD230值越高，表明DNA純度越高；反之，腐殖酸污染越嚴重。由于蛋白質(zhì)在280nm處有個(gè)吸收峰，通過(guò)估算OD260/OD280值可確定DNA中蛋白質(zhì)的污染程度：純的DNA的OD260/OD280值為1.8；越接近1.8表明DNA越純；小于1.8表示有蛋白質(zhì)或酚污染。

3．總DNA直接用于PCR擴增為了驗證提取的DNA是否含有雜質(zhì)，以細菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴增，能直接擴增到16S rDNA片段，說(shuō)明提取的DNA比較純，可以直接用于后續操作。

【研究目標】

（1）建立一種適合的土壤微生物總DNA的提取方法。

（2）提取的DNA質(zhì)量達到可直接用于PCR分析的要求。

?